Desenvolvimento e caracterização de um imunossensor eletroquímico para detecção de anticorpos anti-toxina botulínica do sorotipo A

Abstract

A aplicação da toxina botulínica (BoNT/A) no mercado terapêutico e estético movimenta bilhões de dólares anualmente. Como neurotoxina potente, a BoNT/A exerce sua ação nas junções neuromusculares e nos gânglios autonômicos ao inibir a liberação de acetilcolina. Esse bloqueio resulta em uma paralisia flácida temporária, manifestada por fraqueza e atrofia muscular controlada. Desse modo, é amplamente empregada no tratamento de distúrbios associados à transmissão neuromuscular e na medicina estética. Em muitos casos, o tratamento com BoNT/A é crônico, entretanto, a aplicação em doses ou planos incorretos e/ou seu uso repetitivo pode induzir uma resposta imune, com a formação de anticorpos contra a toxina. Para evitar a aplicação terapêutica ineficaz nesses pacientes, a detecção precisa de anticorpos anti-BoNT/A é fundamental. Atualmente, as formas de detecção consistem em bioensaios que utilizam modelos animais, dependem de um maior tempo para análise, possuem alto custo e requerem laboratórios especializados para a sua execução. Uma alternativa eficiente é a utilização de sistemas de detecção eletroquímica baseados em imunossensores. Imunossensores são dispositivos de baixo custo, simples operação e diagnóstico rápido, além de possuírem potencial de miniaturização para uso em sistemas pointof-care. Neste sentido, o presente projeto tem como objetivo a construção de um sistema eletroquímico inédito para a detecção e quantificação de anticorpos antiBoNT/A. Foi desenvolvida uma plataforma composta por um eletrodo de carbono vítreo oxidado (ox-ECV) modificado com nanopartículas de ouro (AuNPs) estabilizadas por cloreto de 3-n-propil-(2-amino-4-metil)piridínio silsesquioxano (SiAmPy). Esse nanohíbrido foi caracterizado por UV-Vis, MEV, DLS e Potencial . A plataforma ox-ECV/AuNPs-SiAmPy foi caracterizada por técnicas eletroquímicas (Espectroscopia de Impedância Eletroquímica - EIE e Voltametria Cíclica – VC), sendo, subsequentemente, realizada a imobilização da toxina botulínica (BoNT/A) para a confecção do biossensor ox-ECV/AuNPs-SiAmPy/BoNT/A/BSA. Esse biossensor foi capaz de detectar os anticorpos anti-BoNT/A, que alteram a resposta eletroquímica do eletrodo utilizando sonda redox K3[Fe(CN)6] -3/-4 nas medidas. O sistema foi otimizado através de um planejamento fatorial 2 2 , no qual foram estabelecidas a concentração de 1U da toxina e o tempo de incubação de 30 minutos para a construção do sensor. A curva analítica foi obtida pela técnica de EIE e apresentou uma faixa de detecção de 0,1 a 1,0 ng·mL-1 , com um LD = 0,0644 ng·mL-1 e um LQ = 0,1953 ng·mL-1 . O dispositivo apresentou precisão satisfatória em termos de repetibilidade e reprodutibilidade, além de seletividade e especificidade na detecção. Adicionalmente, apresentou capacidade de detectar a presença de anticorpos em matriz complexa, como amostras de soro humano e estabilidade do dispositivo por no mínimo 6 dias. O biossensor configura-se como uma ferramenta promissora para a detecção de anticorpos anti-BoNT/A com aplicabilidade na prática clínica.