Expressão heteróloga e estudos estruturais das enzimas leucil e valil-tRNA sintetases de Trypanosoma cruzi e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Babesia bovis

Abstract

A determinação das estruturas tridimensionais de proteínas de patógenos ajuda a compreender seu funcionamento em detalhes e a identificar características que as distinguem das proteínas homólogas dos hospedeiros. Esse conhecimento, adjuntado à interpretação dos dados estruturais já disponíveis, serve de base para estudos computacionais diversos. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo expressar e caracterizar estruturalmente as enzimas leucil e valil-tRNA sintetases de Trypanosoma cruzi (TcLeuRS e TcValRS, respectivamente) e Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase de Babesia bovis (BbGAPDH). A TcLeuRS foi superexpressa, no entanto, majoritariamente na fração insolúvel, impossibilitando as etapas de purificação e posteriores ensaios de cristalização. A TcValRS foi superexpressa e, apesar da pequena quantidade na fração solúvel observada no SDS-PAGE, purificada e quantificada. Seu rendimento foi de aproximadamente 750 L a 1 mg mL-1 , o que impossibilitou ensaios de cristalização. Já para a BbGAPDH, o protocolo para expressão e purificação foi desenvolvido com rendimento de 28 mg de proteína pura por litro de meio de cultura. Para sua cristalização, remoção da cauda de histidina foi essencial. Cristais difrataram à resolução de 3,12 Å no grupo de espaço P3121; a estrutura 3D foi refinada contendo moléculas do cofator NAD+ observadas em seus respectivos sítios. Comparações com o modelo teórico indicaram uma série de diferenças na conformação de cadeias laterais. Esses resultados fornecem suporte para futuros ensaios de inibição enzimática, além de ensaios de cristalização de complexos com potenciais inibidores.

Three dimensional structure determination of pathogen proteins helps to understand their functions in detail and to identify characteristics that distinguish them from homologous host proteins. This knowledge, along with the interpretation of already available structural data, serves as basis for several computational studies. Thus, the present work aimed to express and structurally characterize the leucyl and valyl-tRNA synthetases enzymes from Trypanosoma cruzi (TcLeuRS and TcValRS, respectively) and the Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase from Babesia bovis (BbGAPDH). TcLeuRS was overexpressed, nevertheless, mostly in the insoluble fraction, making purification and subsequent crystallization assays impossible. TcValRS was overexpressed and, despite the small amount in the soluble fraction observed at SDS-PAGE, it was purified and quantified. The yield was approximately 750 µL at 1 mg mL⁻¹, what prevented crystallization assays. For BbGAPDH, the expression and purification protocol was developed to a yield of 28 mg of pure protein per liter of culture medium. For crystallization, his-tag removal was essential. Crystals diffracted at a resolution of 3.12 Å in the P3121 space group; the 3D structure was refined containing NAD+ cofactor molecules observed in their respective sites. Comparisons with the theoretical model indicated several differences in the conformation of side chains. These results provide support for future enzyme inhibition assays, as well as for crystallization assays of complexes with potential inhibitors.